Titel: Bioprocess development for the syntheses of selected phosphorylated metabolites
Sprache: Englisch (United States)
Autor/Autorin: Molla, Getachew Shibabaw
Schlagwörter: Synthesis of sn-glycerol-3-phosphate;Synthesis of L-glyceraldehyde-3-phosphate;Synthesis of D-glyceraldehyde-3-phosphate;Mechanistic elucidation of the Mg2+ to ATP ratio effect by NMR;In situ ATP regeneration
Erscheinungsdatum: 2017
Zusammenfassung (deutsch): Die Synthese von enantiomerenreinen phosphorylierten Metaboliten in vitro ist von großem Nutzen für diverse natürliche biologische und synthetische Prozesse. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Bioprozesses zur Synthese von sn-Glycerin-3-phosphat (sn-G3P), L-Glyceraldehyd-3-phosphat (L-GAP) und D-Glyceraldehyd-3-phosphat (D-GAP). Die asymmetrische Phosphorylierung von Glycerin katalysiert durch Cellulomonas sp. Glycerinkinase (EC 2.7.1.30) unter Verwendung von ATP als Phosphorylquelle und Mg2+ als essentiellen Aktivator wurde zur Synthese von sn-G3P genutzt. Das Enzym zeigt die maximale Aktivität bei einem optimalen Verhältnis Mg2+ zu ATP von 0.12 – 0.3. Für das Enzym wurde sowohl in Bezug auf Glycerin als auch ATP eine Michaelis-Menten-Kinetik bei konstantem Mg2+ zu ATP Verhältnis und eine zweistufige Kinetik in Bezug auf ATP bei festgelegter Mg2+-Konzentration gefunden. Unterstützt durch 31P- und 1H-NMR spektroskopische Untersuchungen wurden detaillierte kinetische und mechanistische Analysen durchgeführt. Die zweistufige Kinetik in Bezug auf ATP bei konstanter Mg2+-Konzentration basiert auf der Bildung von mehreren Mg-ATP-Komplexen. Das aktive Zentrum der Glycerinkinase zeigt unterschiedliche katalytische Eigenschaften gegenüber den verschiedenartigen Mg-ATP-Komplexen. Die Validierung der Reaktionskinetikmodelle zeigt eine 96.8%-ige und eine 98.8%-ige 2-D-Korrelation zwischen den experimentellen und nummerisch simulierten Daten. Die durch Glycerinkinase aus Cellulomonas sp. katalysierte Phosphorylierung von L-Glyceraldehyd mit ATP wurde zur Synthese von L-GAP entwickelt. Beim pH-Wert der Reaktion von 8 wird das L-GAP mit einer Halbwertszeit von 6.86 Stunden zersetzt. Das Enzym zeigt seine maximale Aktivität bei einem optimalen Mg2+ zu ATP Verhältnis von 0.7. Die Validierung des Reaktionskinetikmodells zeigt eine 99.9%-ige 2-D-Korrelation zwischen den experimentellen und nummerisch simulierten Daten. Die effizienteste Prozessführung zur Synthese von L-GAP kann nach experimentellen und numerischen Evaluierungen im Satz-Betrieb erzielt werden. Zur Synthese von D-GAP wurde ein einstufiges, enzymatisches Verfahren entwickelt unter Benutzung von Fructose-1,6-biphosphataldolase (EC 4.1.2.13) und sn-Glycerin-3-phosphatdehydrogenase (EC 1.1.1.8) beide aus Kaninchenmuskel und Candida boidinii Formiatdehydrogenase (EC 1.2.1.2). Die Reaktionssequenz umgeht die thermodynamische Limitierung der Aldolspaltung des D-Fructose-1,6-biphosphats (D-F16BP), was zum 100%-igen Umsatz bezogen auf D-F16BP führt. Ein Kinetikmodell zur Beschreibung der gesamten Reaktionskaskade wurde entwickelt und validiert unter 98.5%-iger Übereinstimmung der experimentellen und numerischen Daten. Die Evaluierung unterschiedlicher Reaktortypen wurde durchgeführt. Als vielversprechendste Prozessführung stellte sich ein einstufiger Rührkesselreaktor zur enzymatischen Synthese von D-GAP heraus.
Zusammenfassung (englisch): An in vitro synthesis of optically pure phosphorylated metabolites is useful in various natural biological and synthetic processes. The aim of this thesis was to develop bioprocesses for the syntheses of sn-glycerol-3-phosphate (sn-G3P), L-glyceraldehyde-3-phosphate (L-GAP) and D-glyceraldehyde-3-phosphate (D-GAP). Asymmetric phosphorylation of glycerol catalyzed by glycerol kinase from Cellulomonas sp. (EC 2.7.1.30) utilizing ATP as a phosphoryl donor and Mg2+ as an essential activator was used for the synthesis of sn-G3P. This enzyme exhibits maximum activity at the optimum Mg2+ to ATP molar ratio of [0.12 to 0.3]. The enzyme shows Michaelis-Menten kinetics with respect to glycerol as well as ATP maintaining constant Mg2+ to ATP molar ratio and two-step kinetics with respect to ATP at a fixed concentration of Mg2+. Detailed kinetics and mechanistic analyses were performed applying 31P and 1H NMR. The two-step kinetics with respect to ATP at the fixed Mg2+ concentration is due to the formation of multiple Mg-ATP complexes. The active site of glycerol kinase exhibits different catalytic property with respect to different Mg-ATP complex species. Validation of reaction kinetics models shows 96.8% and 98.8% 2-D correlation of experimental and numerically simulated data matrices. Glycerol kinase from Cellulomonas sp. catalyzed phosphorylation of L-glyceraldehyde by ATP was developed for the synthesis of L-GAP. L-GAP decomposes at the reaction of pH 8 and shows a half-life of 6.86 h. The enzyme exhibits maximum activity at the optimum Mg2+ to ATP molar ratio of 0.7. Validation of reaction kinetics model shows 99.9% 2-D correlation of experimental and numerically simulated data matrices. Experimental and numerical evaluations of different reactor types reveal that batch-wise operation is the most convenient process for the synthesis of L-GAP. A one-pot enzymatic reaction sequence was designed for the synthesis of D-GAP using fructose-1,6-bisphosphate aldolase from rabbit muscle (RAMA) (EC 4.1.2.13), sn-glycerol-3-phosphate dehydrogenase (sn-G3PDH) from rabbit muscle (EC 1.1.1.8) and formate dehydrogenase from Candida boidinii (FDH) (EC 1.2.1.2). The reaction sequence circumvents the thermodynamic limitation of aldol cleavage of D-fructose-1,6-bisphosphate (D-F16BP) that leads to 100% conversion of D-F16BP. A reaction kinetics model defining the entire reaction cascade was developed and validation of the model shows 98.5% 2-D correlation of experimental and numerically simulated data matrices. The evaluation of different reactor types was performed. Batch-wise operation in STR is the most convenient procedure for the one-pot enzymatic synthesis of D-GAP.
URI: http://tubdok.tub.tuhh.de/handle/11420/1389
URN: urn:nbn:de:gbv:830-88216172
DOI: 10.15480/882.1386
Institut: Technische Biokatalyse V-6
Dokumenttyp: Dissertation
Hauptberichter: Liese, Andreas
Sponsor / Fördernde Einrichtung: Federal Ministry of Education and Research of Germany (BMBF), P28, project number: 0316055)
Enthalten in den Sammlungen:tub.dok

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